微生物カテゴリーを事前に識別することの重要性

当社での「微生物カテゴリーの識別」とは、細菌・酵母・カビの何れに該当するのかを判断することです。微生物の同定では、カテゴリー毎に試験・分析項目が異なるため、予めカテゴリーを知っておくことが重要となります。

例えば、遺伝子解析による同定の場合、対象微生物が細菌であるのか、カビや酵母であるのかのカテゴリーの判断を誤ると、適切なDNA抽出方法で試験できないことや、細菌に対してカビや酵母などの菌類に特有の遺伝子配列を増幅するプライマーを用いてしまうと、目的のPCR産物が得られないなど、分析を進めることができなくなります。

そこで、本コラムでは、当社で取り扱う微生物の中で、細菌・酵母・カビを見分けるための実践的な識別方法について紹介します。まず、目視および顕微鏡によるコロニー観察によって簡易的に微生物カテゴリーを識別することが可能です。より確実に微生物カテゴリーの識別を行うためには、各コロニーから作製したプレパラートについて、光学顕微鏡を用いた細胞形態観察が必要となります。

コロニー観察と作製したプレパラートの顕微鏡観察操作を繰り返して、経験を積むことで、コロニー観察による微生物カテゴリーの識別の精度は向上します。当社のテクニカルトレーニングでは、実際にコロニー観察や微生物カテゴリーの識別方法を体験いただけます。

１. コロニーの観察による識別

寒天上に形成されたコロニーの目視（肉眼）および顕微鏡観察を行います。

1-1. コロニーの目視および実体顕微鏡観察による簡易的な識別方法

1)　本コラムにおける「コロニー色調」の「明色系」は白色（乳白色）、クリーム色、黄色、ピンク色などを示し、「暗色系」は褐色（茶褐色～黒褐色）、黒色や青／緑色などを示します。
2)　コロニーの質感は、実際にコロニーを白金耳等で触れた場合の感触を表現しています（やや感覚的な表現にはなります）。

1-2. コロニー周縁部の顕微鏡観察による簡易的な識別方法

コロニー周縁部を、寒天平板培地の裏面から光学顕微鏡で観察します。

【手順】平板培地を裏返しにした後、光学顕微鏡のステージに載せて、低倍の対物レンズ(例えば10倍)を使用して観察します。
【注意】この観察方法による識別が困難な場合は、プレパラートを作製して細胞形態を観察する必要があります。

２. 細胞形態の観察による識別

コロニーから菌体の一部を掻き取って作製したプレパラートを用いて、光学顕微鏡で細胞形態を観察します。なお、細菌の観察はグラム染色法が常用されますが、ここでの細胞形態観察はグラム染色ではなく、滅菌水をマウント液として作製するプレパラート観察方法によります。

1) 細菌の仲間の放線菌は、カビと同じような菌糸成長・胞子形成をします。しかし、放線菌の細胞サイズはカビよりも一回り小さいため、カビとの識別が可能です（例えば、菌糸の幅は1µm以下）。

2) 球菌などの球形の細胞のサイズは直径で、桿菌などの長方形あるいは卵円形の細胞は「長さ（長径）×幅（短径／太さ）」（長さは種類によって様々）で示されることが多いです。本コラムでは、細菌・酵母・カビの細胞サイズを分かりやすく比較できるように、「幅」で表記しています。

注）細菌のように細胞サイズが小さい場合、水等でマウントした場合、ブラウン運動のため細胞観察が難しい場合があります。その際は、マウント液の量を少なめにして、少々時間をおくことで多少観察しやすくなる場合がありますが、確実な観察にはグラム染色がお勧めです。

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１，製品に異臭、変色、膨張などが確認された場合、それが微生物によるものかどうか判断がつかない際には、当社試験項目「微生物確認試験をご参照ください。

２，当社の微生物試験項目一覧

細菌分類学において16S rRNA遺伝子 (16S rDNA) に基づく分子系統解析は、分類階級「門、綱、目、科、属、種」を推定するための根幹となる方法として使用されています。当社の16S rDNA解析では、①当社細菌基準株データベースと国際塩基配列データベースに対する相同性検索結果 (BLAST)、②分子系統解析の結果を基にした同定結果をご報告しています。本コラムでは16S rDNA解析により種または属レベルでの同定結果が得られる際の判断基準を紹介します。

1) 種レベルでの同定結果が得られるケース

Stackebrandtら¹⁾ が提唱した16S rDNAに基づく種の異同の判断基準において、「16S rDNA塩基配列 (約1,500 bp) の相同率が98.7%以下を示す菌株同士は、別種である」とされています。しかし、「同種であること」を判断できる境界線は定められておらず、1塩基でも明確な相違が認められる場合は別種である可能性を考慮する必要があります。したがって、種レベルで同定となるケースは以下の場合に限られます。

どちらかに該当する場合、A,Bのように分子系統樹において、検体と同一の分子系統学的位置 (既知種との間に横枝が無い状態) を示す既知種が存在します。

また、「種」よりも低次の分類階級として「亜種」が存在する場合、16S rDNA解析に加えて機能性遺伝子解析や生化学性状試験などに基づき分類が行われていることから、16S rDNA解析のみで亜種の同定を行うことは困難です。しかし、亜種間の16S rDNA塩基配列が数塩基異なる場合、例えば図1-Bのように、検体BはStaphylococcus succinusの2亜種の内、塩基配列が100%一致したStaphylococcus succinus subsp. succinusに帰属する可能性があると判断することができます。 

2) 種レベルでの同定が難しく属レベルとなるケース

1) で述べたように、既知種に対して1塩基でも明確な相違が認められる場合は別種である可能性を考慮する必要があり、種レベルでの同定を行うことが困難になります。そのような場合、次に「種」の上位の分類階級である「属」レベルで検体を同定できるかを検討します。属レベルでの同定となる場合は以下の通りです。

いずれにも該当する場合、分子系統樹において、検体と同一の分子系統学的位置を示す既知種が存在せず、既知種のいずれに対しても距離 (系統樹の横枝) が認められます。さらに、検体は特定の属が形成するクラスターの中に含まれる場合に属レベルで同定されます。

16S rDNAに基づく分類が始まり約40年が経過した現在、国際的に承認されている細菌の種数は15,000種を超えており、一般的な環境サンプルから分離される菌株の多くについては、属レベルまたは種レベルでの同定結果が得られるようになっています。近年、ゲノム解析の進展により細菌の分類体系の整備がますます進むことが予想されますが、16S rDNAに基づく同定方法は、迅速さや再現性の面から今後も細菌分類学の基礎試験として使用され続ける方法と考えられます。そのため同定結果の解釈の理解を深めることは、研究や日々の衛生管理の業務に役立つと思います。

参考文献

＊当社の試験項目と同定結果の関係

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乳酸菌・酵母の分離

地域活性化の一つとして、地域で植生する食経験のある植物や農作物（花、果実など）、または伝統的な食品から乳酸菌や酵母などを分離し、特産品として食品や飲料の開発が行われています。乳酸菌はヨーグルト、ぬか漬けや漬物、酵母は日本酒、ビール、ワインなどのアルコール発酵やパン生地の発酵の際に活躍する微生物です。私たちは知らず知らずの内に発酵食品に含まれる乳酸菌や酵母を口にしています。

微生物とその生育環境により発酵時に生み出される成分とその生産量が異なることから、その土地や風土の違いで風味や香りなどの異なる特徴的な商品が生み出されます。桜から分離された酵母を用いた日本酒（山口県、青森県）の他、岐阜県、長野県、静岡県、沖縄県などでは地域乳酸菌を利用し、製品化・実用化に向けた研究が進められています。
分離した乳酸菌や酵母を食品利用する際には、安全性の担保は不可欠です。まずは微生物を同定することで様々な情報（利用例や病原性など）を得ることが重要と考えます。

分離後の当社おすすめ追加試験

当社では皆様のご要望に応じた以下のような試験をご用意し、乳酸菌や酵母等の有用微生物の同定、ご目的に応じた特性解析及び保存・保管までをトータルにサポートいたします。

微生物分離（乳酸菌、酵母）

・乳酸菌分離（グラム染色観察、カタラーゼ試験を含む）
・酵母分離（顕微鏡観察による確認作業含む）

平板培養におけるコロニーの形成

平板培養におけるコロニーの形成には、菌種の違い以外に、塗抹/接種方法が大きく影響します。
試験・分析をなるべく短い時間で完了するためにも、塗抹/接種方法は重要です。
下図は、当社にお送りいただく検体の事例を示したものです。

培養による純度確認には、細菌は3日、酵母は5日、カビは7日程度の作業日数が必要となります。
純化作業が必要な場合は、コロニーの状態により、複数回の塗抹培養を繰り返す事があります。この場合、1週間～10日程度掛かることもあります。

平板内が単一種で構成され、単一のコロニーを形成していれば、そこから釣菌した再培養やDNA抽出が容易に行えます。

複数の菌が混在する場合においても、単一のコロニーが認められれば、ご目的のコロニーに〇印などの印を付けていただくことで、スムーズな解析が行えるケースがあります。

単一コロニーの形成が認められないため、培養確認または、純化作業が必要になります。 本試験の納期日とは別に、培養確認、純化作業の作業日数が必要となります。

酵母の一種 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (サッカロミケス・セレビシエ／サッカロマイセス・セレビシエ) は酵母の一種で、「出芽酵母」や「パン酵母」というと一般的にこの種を示します。ビールや日本酒などのアルコール醸造に欠かせない微生物であると同時に、ヒトと同じ真核生物であることから、モデル生物として古くから様々な研究がなされてきました。「出芽酵母」という名前の通り、1つの母細胞の端から芽が出るように膨らみが生じ、娘細胞ができます。娘細胞が母細胞と同じくらいの大きさまで成長した後、母細胞 (親元) を離れて増殖していきます。セレビちゃんのイメージはこの出芽している状態を表しています。

正式な名前 (学名) は、「Saccharomyces cerevisiae (Desm.) Meyen」であり、1838年にMeyenによって命名されました。分類学的には、カビやきのこと同じ「菌類界」に属し、その中でも「子嚢菌門・サッカロミケス亜門・サッカロミケス綱・サッカロミケス目・サッカロミケス科・サッカロミケス属」に分類される種になります。属名の「Saccharomyces」は「ギリシャ語の σάκχαρον (sakcharon) 起源のラテン語の糖 Saccharum とギリシャ語の菌 μύκηs (myces) の複合語で、種小名の「cerevisiae」は「ビールを意味するケルト語起源のラテン語である Cerevisia の属格 Cerevisiae」に由来します。その学名の通り、S. cerevisiaeは糖を代謝しアルコール発酵を行うことが大きな特徴です。自然界のS. cerevisiaeは各種の果実や果汁などの糖質原料、土壌、海や川、葉、樹液などさまざまな場所に生育しています。

当社では植物などの環境サンプルから乳酸菌や酵母など有用菌のスクリーニングにも対応した
分離した微生物(細菌・カビ・酵母対象)を同定するの各種微生物試験サービスをご用意しております。